Laporan Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp.

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

            Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariot dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas dibandingkan mahluk hidup lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang hidup didarat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim (Anonim,2011).         

            Teknik biakan murni digunakan untuk memisahkan berbagai macam bakteri. Peranan bakteri baik yang menguntungkan ataupun yang merugikan dalam kehidupan melalui proses isolasi dan identifikasi. Prinsip isolasi bakteri adalah memisahkan suatu mikroba dari mikroba lainnya sehingga diperoleh kultur murni. Identifikasi dilakukan setelah kultur murni yang berasal dari satu progeni didapatkan untuk diketahui potensinya, namun sebelum dilakukan identifikasi bakteri harus sudah diklasifikasikan. Klasifikasi merupakan proses untuk mengenali dan mengelompokkan organisme hidup. Tujuan dari klasifikasi adalah untuk mengatur kedudukan dari berbagai organisme di alam. Langkah identifikasi adalah inokulasi, inkubasi, isolasi, eksaminasi dan identifikasi. Identifikasi bakteri didasarkan pada berbagai macam sifat bakteri seperti sifat biokimia, morfologi koloni dan morfologi selnya.

            Bakteri Bacillus sp. biasanya banyak ditemukan di tanah. Cara untuk mendapatkan bakteri Bacillus sp. yaitu dengan mengambil sampel tanah menggunakan sendok yang telah disterilisasikan terlebih dahulu kemudian ambil tanah sekitar kedalaman 3 cm dari permukaan tanah. Bacillus sp. merupakan bakteri gram positif dengan sel batang berukuran 0,3-22x1,27-7 πm, sebagian bersifat motil (mampu bergerak) mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel, jika dipanaskan akan membentuk endospora, yaitu bentuk dorman sel vegetatif sebagai bentuk pertahanan diri yang muncul saat kondisi ekstrim yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora dibentuk dalam sporangium di dalam sel dan dibentuk saat sel masak. Endospora memiliki dinding tebal, reaktif, dan sangat resisten. Letak endospora dalam sel ukuran selama pembentukannya tidak sama antara spesies satu dengan lainnya. Beberapa spesies memiliki spora sentral, terminal, atau letal. Endospora dapat berbentuk oval, silindris, bulat, atau lainnya.

Gambar. Bacillus sp

        Bacillus sp. bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, metabolisme dengan fermentasi dan respirasi. Isolat-isolat murni tersebut dipelihara dalam medium agar miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Bacillus, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecetan gram, pengecetan negatif dan motilitasnya. Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainnya berdasarkan sifat-sifatnya yaitu: keseluruhannya merupakan pembentuk spora, hidup pada kondisi aerob baik sebagai jasad yang sepenuhnya aerob maupun aerob fakultatif, selnya berbentuk batang, dan memproduksi katalase. 

B. Tujuan

            Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi bakteri Bacillus sp. dan mengidentifikasi bakteri Bacillus sp. hasil isolasi dengan pendekatan mikrobiologis.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

            Alat yang digunakan adalah jarum ose, object glass, mikroskop, mikrometer, kertas merang, tissue, tabung reaksi, pipet tetes, beaker glass, cawan petri, oven, pembakar spirtus, inkubator, wrapper.

            Bahan yang digunakan adalah akuades, alcohol 70%, medium Nutrient Agar (NA), Nitrat Broth (NB), Malachite Green, Starch Agar (SA), SIMA semisolid, Skim Milk Agar (SMA), Simon Citrat, MR-VP Broth, KOH-alffanaftol, reagen A dan B, NaCl (0%, 6,5%, 10%), Kristal Violet. Lugol’s iodine, safranin, etanol 96%, reagen H2O2, reagen lactose, rafinosa, reagen oksidase.

B. Metode

a. Pengambilan Sampel

Ø  Pengambilan dilakukan secara aseptis

Ø  Alumunium foil yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%

Ø  Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam alumunium foil steril kemudian ditutup rapat

b. Tahapan Isolasi Bacillus

Ø  Preparasi suspense dilakukan, sebelumnya sampel tanah dimasukkan kedalam tabung pengenceran pertama kemudian direbus 10 menit dengan suhu 80^oC diatas dandang.

Ø  Diinokulasikan sebanyak 1 ose pada medium NA, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30^oC selama 2x24 jam.

c. Tahap Pemurnian Dengan Metode Streak Kuadran

Ø  Dipilih satu koloni yang Nampak terdiri dari satu tipe sel

Ø  Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan distreak pada plating NA

Ø  Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan NA

Ø  Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streak primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan kestreak sekunder tanpa kembali streak primer

Ø  Jarum ose dibakar, angkat lalu dinginkan dan disteakan melewati streak sekunder dan kemudian dilanjutkan kestreak tersier tanpa kembali kestreak primer dan sekunder

Ø  Diinkubasi pada suhu 30^OC selama 2x24 jam

d. Pengamatan Morfologi Koloni

Ø  Dibuat biakan pada media Nutrient Agar (NA) cawan

Ø  Inkubasi 2x24 jam pada suhu 30^oC

Ø  Perbedaan bentuk koloni, bentuk tepi, elevasi dan lainnya diamati

e. Pengukuran Panjang dan Lebar Sel

Ø  Disiapkan mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang terkalibrasi

Ø  Dibuat preparasi ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana dengan menggunakan pewarnaan metilen blue

Ø  Diukur panjang dan lebar sel kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya (µm).

f. Uji Pewarnaan Gram

Ø  Dibuat ulasan bakteri pada object glass, difiksasi

Ø  Ditetesi dengan gram A (kristal violet), dibiarkan selama 60 detik

Ø  Dicuci dengan air mengalir, keringanginkan

Ø  Ditetesi dengan gram B (lugol’s iodin), dibiarkan selama 60 detik

Ø  Dicuci dengan gram C (ethanol 96%) setetes demi setetes sampai etanol yang jauh berwarna bening dan jangan sampai terlalu banyak.

Ø  Ditetesi dengan D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan dikeringanginkan

Ø  Diamati dibawah mikroskop

g. Uji Pewarnaan Endospora

Ø  Dibuat ulasan bakteri pada object glass lalu ditutupi dengan kertas merang

Ø  Ditetesi dengan Malachite Green diatas kertas merang dan diletakkan di atas air mendidih. Dibiarkan selama 5 menit, jika pinggir mulai mengering tambahkan lagi Malachite Green

Ø  Setelah dingin , object glass dibilas dengan aquades mengalir

Ø  Ditetesi dengan safranin sebagai counter stain

Ø  Didiamkan selama 45 detik

Ø  Dicuci dan dikeringanginkan

Ø  Diamati di bawah mikroskop

h. Uji Motilitas

Ø  Diinokulasikan bakteri uji pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose

Ø  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 30^oC

Ø  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitas koloni menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif.

i. Uji Hidrolisis Starch

Ø  Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose

Ø  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC

Ø  Kemudian permukaan media digenangi dengan larutan Lugol’s iodine

Ø  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitas koloni menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih (warna biru reagen) menandakan hasil uji negatif.

k. Uji Hidrolisis Kasein

Ø  Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat Skim Milk Agar (SMA) sebanyak 1 ose.

Ø  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC

Ø  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitas koloni menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif.

l. Uji VP (Voges Proskaner)

Ø  Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak satu ose

Ø  Diinokulasikan bakteri uji pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose

Ø  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 30^oC 

Ø  Bakteri ditetesi dengan alfanaftol 3 tetes dan KOH 40 % 2 tetes

Ø  Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negatif.

m. Uji Katalase

Ø  Dibuat preparat ulas bakteri pada object glass

Ø  Ditetesi dengan larutan H²O²

Ø  Diamati perubahan yang terjadi

Ø  Jika terbentuk gelembung gas menunjukan bahwa hasil uji positif dan sebaliknya

n. Uji Oksidase

Ø  Dibuat preparat ulas bakteri pada object glass, tutup dengan potongan tissue

Ø  Ditetesi dengan reagen oksidase

Ø  Diamati perubahan yang terjadi

Ø  Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil negatif tidak terbentuk warna biru marun.

o. Uji Penggunaan Sitrat

Ø  Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simon Citrate sebanyak 1 ose

Ø  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC

Ø  Diamati perubahan yang terjadi, jika hasil positif media berwarna biru sedangkan hasil negatif tetap berwarna hujau.

p. Uji Lactosa dan Raffinosa

Ø  Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Lactosa dan Raffinosa           

Ø  Diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC

Ø  Diamati perubahannya, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.

q. Uji Toleransi NaCl

Ø  Dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang mengandung NaCl 0%, 6,5%, dan 10%

Ø  Isolat diinokulasikan dengan streak kontinyu

Ø  Diinokulasikan selama 2x24 jam pada temperature 30^oC

Ø  Diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan dengan media

r. Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi

Ø  Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber

Ø  Ditentukan persen homologinya dengan rumus:

% Homologi=

III.       HASIL DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil

Tabel 1. Pengamatan Morfologi sel

No	Pengamatan	Hasil
1.	Bentuk koloni	Circular
2.	Ukuran	Moderate
3.	Elevasi	Convex
4.	Margin	Entire
5,	Permukaan	Halus mengkilap

Tabel 3. Perbandingan Isolat dan Spesies-spesies Bacillus

No	Jenis Uji	Isolat	A	B	C	D	E
1.	Gram	+	+	+	+	+	+
2.	Endospora	+	+	+	+	+	+
3.	Katalase	+
4.	Starch	+	+	+	+	+	+
5.	Casein	+	+	+	+	+	+
6.	Rafinossa	-	-	-	-	d	+
7.	NaCl 10%	-	+	D	d	-	d
8.	Sitrat	-	-	D	+	+	+
9.	Motilitas	-	-	+	+	+	+
10.	VP	+	+	+	+	-	+
11.	Oksidase	+	d	D	d	-	-

Tabel 4. Pengukuran Homologi

No	Jenis Uji	IA	IB	IC	ID	IE
1.	Gram	1	1	1	1	1
2.	Endospora	1	1	1	1	1
3.	Starch	1	1	1	1	1
4.	Casein	1	1	1	1	1
5.	Rafinossa	1	1	1	0	0
6.	NaCl 10%	0	0	0	1	0
7.	Sitrat	0	0	0	0	0
8.	Motilitas	1	0	0	0	0
9.	VP	1	1	1	0	1
10.	Oksidase	1	1	1	0	0
Jumlah  karakter yang sama		8	7	7	5	5

Keterangan :

d    =    16-84% strain positif

A   =    Bacillus anthracis

B   =    Bacillus cereus

C   =    Bacillus thuringiensis

D   =    Bacillus megaterium

E    =    Bacillus subtilis

Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu antara isolat dengan spesies A (Bacillus anthracis).

B. Pembahasan

             Pengambilan sampel (tanah kandang) dilakukan dengan cara sterilisasi sendok yang ingin dipakai terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf kemudian ambil sampel tanah kedalaman 3cm dari permukaan, masukkan kedalam alumunium foil yang sebelumnya disterilisasikan terlebih dahulu dengan menggunakan alkohol 70% kemudian ditutup rapat. Pengambilan sampel dilakukan dengan mensterilisasikan alat terlebih dahulu agar dapat dilindungi dari kontaminasi. Dilakukan dengan prosedur kerja aseptik dengan senyawa desinfektan yang sesuai. Menyesuaikan wadah sampel yang diambil dan metode yang sesuai dengan jenis sampel.  Kemudian sampel yang mengandung bakteri tersebut dijaga agar tetap menggambarkan kondisi yang ada sebelum memasuki tahap analisa (Anonim, 2011).
v    Isolasi Bacillus sp. dilakukan dengan cara sampel tanah yang telah didapat dimasukkan kedalam tabung yang berisi akuades steril kemudian direbus 10 menit dengan suhu 80oC diatas dandang, tanah rebusan diinokulasikan kedalam cawan yang telah berisi medium NA kemudian disreak sinambung, inkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang. Proses perebusan dilakukan agar bakteri yang diinginkan (Bacillus sp.) membentuk endospora. Terbentuknya endospora bertujuan untuk melindungi bakteri dari lingkungan yang kurang menguntungkan (Sudjadi, 2006).

             Misalnya, lingkungan yang terlalu kering, banyak mengandung bahan kimia, dan panas yang terlalu tinggi. Endospora memiliki dinding yang tebal, oleh karena itu bakteri yang menghasilkan endospora dapat bertahan hidup pada lingkungan yang ekstrim. Jika keadaan lingkungan membaik, maka pembungkus spora segera pecah dan bakteri kembali memulai aktivitas hidupnya sebagaimana biasanya. Contoh bakteri yang menghasilkan endospora adalah Bacillus dan Clostridium (Sudjadi, 2006).
v    Pemurnian sampel dari hasil yang telah diisolasi dilakukan dengan cara pemilihan satu koloni (koloni tunggal) yang nampak terdiri dari satu tipe sel, amati bakteri Bacillus sp. inokulasikan ke media NA disteak kuadran kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan suhu ruang 30oC. Hasil pemurnian ambil koloni tunggal kemudian diamati bentuk, ukuran, elevasi, permukaan, dan margin didapatkan hasil koloni berbentuk bulat atau circular, berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap, dan margin entre. Bacillus berbentuk bulat (coccus), memiliki permukaan yang halus dan mengkilap (Anonim, 2011). Koloni tunggal yang terbentuk diperiksa menggunakan pewarnaan Gram untuk melihat karakteristik dinding sel dan bentuk dari sel tersebut. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan mikroskop jenis mikroskop cahaya. Untuk pengamatan dinding sel bakteri, digunakan perbesaran sebesar 1000x dan menggunakan minyak imersi (….)Selain diamati ciri-ciri morfologi koloninya hasil pemurnian juga digunakan untuk pembuatan stok di media NA miring kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang.  Pembuatan stok dilakukan dua kali, digunakan untuk melakukan berbagai macam uji.
v    Pengukuran panjang dan lebar sel dilakukan dengan menyiapkan mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang terkalibrasi, dibuat preparat ulas bakteri uji dengan metode pewarnaan sederhana dengan menggunakan pewarnaan metilen blue kemudian diukur panjang dan lebar sel kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya (µm). Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut (Anonim, 2011). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin (Sudjadi, 2006).
            Hasil perhitungan kalibrasi dimana skala object dibagi dengan skala okuler dikali 10 µm didapatkan hasil 2,5 µm, sehingga didapatkan panjang sel sebenarnya, skala panjang dikali hasil kalibrasi yaitu 2,5 µm kemudian lebar sel sebenarnya, skala lebar dikali hasil kalibrasi yaitu didapatkan 2,5 µm. Bacillus thuringiensis atau biasa disebut Bt berbentuk batang dengan ukuran panjang 3-5 μm dan lebar 1,0-1,2 μm. Bacillus antracis yaitu bakteri berbentuk batang berukuran panjang 1-8 μm, lebar 1-1,5 μm (Sudjadi, 2006).
v    Uji pewarnaan gram dilakukan dengan mengulas bakteri pada object glass kemudian difiksasi selama 3-5 kali tujuan dari fiksasi adalah untuk mematikan sel bakteri tanpa merubah bentuk dan strukturnya, membuka pori-pori dari sel bakteri sehingga mudah terwarnai, dan merekatkan bakteri ke object glass (Udin, 2001). Kemudian ditetesi dengan gram A yaitu Kristal violet didiamkan selama 60 detik, pemberian Kristal violet bertujuan untuk memberikan warna dasar atau pewarna primer yaitu pewarnaan dinding sel bakteri (Anonim, 2011).
            Kemudian dicuci keringanginkan, ditetesi lugol’s iodine dibiarkan selama 60 detik bertujuan sebagai pewarna kedua atau pewarna pengganti. Setelah terwarnai dicuci keringanginkan kemudian dicuci dengan gram C (ethanol 96%) setetes demi setetes sampai ethanol yang jatuh berwarana bening, namun jangan sampai terlalu banyak. Berfungsi untuk melarutkan pewarna (decolorizing agent) kemudian ditetesi dengan gram D (safranin) dibiarkan 45 detik lalu cuci keringanginkan, pemberian safranin digunakan sebagai pewarna pembanding (James, 2008). Setelah itu amati dibawah mikroskop. Hasil yang didapat terlihat warna ungu muda. Bakteri gram positif mempertahankan zat warna gentian violet dan bakteri gram negatif mempertahankan warna merah (Udin, 2001)

v    Uji pewarnaan endospora dilakukan dengan mengulas bakteri pada object glass kemudian ditutup dengan kertas merang lalu ditetesi dengan malachite green diatas kertas merang kemudian diuapkan diatas dandang, pemberian malachite green bertujuan untuk melumuri fiksasi panas. Jangan sampai mengering jika kering ditetesi lagi malachite green. Pemanasan bertujuan untuk membantu warna menembus dinding endospora. Kemudian bilas dengan aquades lalu ditetesi dengan safranin sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (James, 2008). Didiamkan selama 45 detik, dicuci keringanginkan kemudian diamati dibawah mikroskop didapatkan hasilkan endospora berwarna hijau sedangkan sel vegetative berwarna merah.

v    Uji mortilitas bakteri yang diinokulasikan pada medium SIMA semisolid sebanyak 1 ose kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang 30^oC, menunjukan tidak adanya pertumbuhan koloni pada medium tegak SIMA yang telah ditusuk dengan jarum ose, hasilnya hanya tumbuh diatas permukaan medium. Banyaknya koloni bakteri yang tumbuh pada suatu substrat sangat dipengaruhi oleh tersedianya kondisi fisik, nutrisi, dan sifat hudupnya (Priyani, 2006). Pertumbuhan dipermukaan medium ini dikarenakan Bacillus merupakan bakteri yang bersifat aerob. Namun tidak membuktikan mortilitas, hal ini disebabkan pada saat menginokulasikan bakteri dengan menggunakan jarum ose, bakteri tersebut tidak masuk ke dalam media hanya tertanam dipermukaan. Namun ada beberapa spesies Bacillus yang tidak bersiat motil salah satunya adalah Bacillus anthracis merupakan bakteri  berbentuk batang, berukuran 1,6 µm, tidak mempunyai alat gerak atau motil (Akoso, 2009).

v    Uji hidrolisis starch dengan menggunakan medium padat Starch Agar sebanyak 1 ose yang diinkubasi selama 2x24 jam dalam suhu ruang kemudian permukaan media digenangi dengan larutan Lugol’s iodine menghasilkan positif karena terbentuknya zona jernih pada media hal ini disebabkan karena  enzim amilase yang bersifat eksoenzim akan memecah amilum menjadi monomer-monomernya. Starch atau pati dipecah menjadi unit-unit yang lebih kecil yaitu dengan memotong ikatan-ikatan glikosidiknya. Salah satu yang dapat memotong ikatan glokosidik adalah enzim amilase (Anonim, 2011).

v    Uji hidrolisis kasein menggunakan medium padat Skim Milk Agar (SMA) diinokulasikan bakteri sebanyak 1 ose kedalam medium tersebut kemudian diinkubasi selama 2x24 jam suhu ruang. Hasil menunjukan positif yaitu terdapatnya zona jernih pada media SMA. Kaseinase akan memecah kasein menjadi parakaseinase yang dapat bereaksi dengan susu tersebut sehingga menghasilkan kalsium parakaseinat.

v    Uji VP (Voges Proskaner) menggunakan medium cair MR-VP yang telah diinokulasikan dengan 1 ose bakteri kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC, bakteri ditetesi dengan alfanaftol sebanyak 3 tetes dan KOH 40% 2 tetes menunjukan hasi positif karena warna media menjadi orange muda mendekati merah. Penambahan alfanaftol akan bereaksi dengan aseton sedangkan pemberian KOH 40% untuk mengoksidasi proses tersebut sehingga terjadi warna orange sampai merah.

            Prinsip dari uji ini adalah menentukan kemampuan beberapa mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir yang netral (asetil-mythyil karbinol) dari fermentasi glukosa. Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan (Sudjadi, 2006).  

            Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alfanaphtol dalam etanol dapat menentukan adanya asetolin (asetilmethylkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintetis 2,3-butanadiol. Penambahan KOH adanya asetolin ditunjukan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alfanaphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasi kembali menjadi asetolin sehingga memperjelas hasil reaksi (Sudjadi, 2006).

v    Uji katalase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object glass, ditetesi dengan larutan H²O² kemudian diamati perubahan yang terjadi hasil menunjukan positif karena terbentuknya gelembung gas. Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan hydrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah yang besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur repirasi aerobik.

            Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk menguraikan khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasikan dengan menambahkan reagen H²O² pada suspense bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif (Anonim, 2011).

v         Uji oksidase dilakukan dengan membuat preparat ulas bakteri pada object glass, ditutup dengan potongan tissue, ditetesi dengan reagen oksidase kemudian diamati perubahan yang terjadi. Hasil yang didapat positif karena hasil ulasan yang telah ditetesi reagen oksidase berwarna biru marun. Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport electron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik. Sifat kemoorganotrop dan fakultatif anaerob pada Bacillus sp. Menyebabkan bakteri ini mampu memanfaatkan sumber karbon tersedia (Priyani, 2006).

            Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghasilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses foforilasi oksidatiif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D- phenylenediaminedihyrocloride. Reagen akan mendonorkan electron terhadap enzim ini sehingga akan terosidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif (James, 2008).

v    Uji penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji pada medium agar miring Simon Citrate sebanyak 1 ose, inkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC kemudian diamati  perubahan yang terjadi, hasil yang didapat adalah negatif karena media tetap berwarna biru. Sumber karbon asam sitrat akan dipecah menjadi oksalo asetat kemudian menjadi asam asetat. Karena adanya proses peningkatan ph sehingga berwarna biru (Anonim, 2011).

v    Uji lactose dan raffinosa dilakukan dengan cara bakteri uji ditumbuhkan pada medium lactosa dan raffinosa, diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC kemudian diamati perubahan warna pada media, hasil menunjukan bahwa warna media tidak berubah tetap berwarna ungu.

v    Uji toleransi NaCl dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang mengandung NaCl 0%, 6,5%, dan 10%, isolate diinokulasikan kedalam ketiga tabung masing-masing 1 ose, diinkubasi selama 2x24 jam pada temperature 30^oC kemudian diamati hasilnya dengan melihat tingkat kekeruhan media. Hasil yang didapat tingkat kekeruhan yang paling tinggi adalah pada konsentrasi NaCl 0%.

v    Penentuan spesies melalui pendekatan homologi dilakukan dengan mengumpulkan data-data yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan data karakter bakteri dari sumber.   Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu antara isolat dengan spesies A (Bacillus anthracis). Karena pengambilan sampel tanah disekitar  kandang maka tanah tersebut mengandung banyak Bacillus anthracis. Bakteri ini banyak menyerang hewan herbivora. Misalnya domba, lembu, unta, rusa, sejenis campuran kuda-keledai, kuda, dan kambing. Bacillus anthracis termasuk klasifikasi gram positif, nonmotile, yang menjadi cikal bakal bakteri spora. Kuman ini berkembang dan bertahan tahunan dalam berbagai keadaan di tanah, air, atau benda apa pun. Vegetasi sel berukuran panjang 8 mikron dengan lebar 1-1,5 mikron ini mampu hidup selama bertahun-tahun di tanah (Akoso, 2009).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

            Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Bacillus sp. memiliki ciri-ciri morfologi sebagai berikut: koloni berbentuk bulat   atau circular, berukuran sedang atau moderate, elevasi convex, permukaan halus mengkilap, dan margin entre.

2. Lebar sel Bacillus sebenarnya 2,5  sedangkan Panjang sel sebenarnya 2,5 .

3.  Hasil uji positif yaitu uji pewarnaan gram, pewarnaan endospora, uji hidrolisis starch, uji hidrolisis kasein, uji VP, uji katalase, dan uji oksidase.

4.  Hasil uji negatif  yaitu uji lactose dan raffinosa, uji motilitas, uji penggunaan sitrat,  dan uji toleransi NaCl.

5.  Berdasarkan hasil perhitungan persen homologi, jumlah terbesar adalah 80% yaitu isolat Bacillus anthracis karena sampel yang digunakan adalah tanah kandang.

B. Saran

            Saran untuk praktikum selanjutnya adalah sebaiknya pada saat praktikum dan pengamatan jangan terlalu pagi, dan lebih diperbanyak lagi  alat-alat praktikum

DAFTAR REFERENSI

Akoso., B. 2009. Epidemiologi dan Pengendalian Anthrax Penyakit Menular pada  Hewan dan Manusia. Penerbit Kanisius (Anggota IKAPI). Yogyakarta.

Anonim. 2011. http://dunia-mikro.blogspot.com/2008/08/pengecatan-endospora.html. diakses pada tanggal 29 November 2011.

                                                         

Anonim. 2011. http://gurungeblog.wordpress.com/2008/11/17/bakteri-ciri-ciri-struktur-perkembangbiakan-bentuk-dan-manfaatnya/. diakses pada tanggal 29 November 2011.

Anonim. 2011. http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri. diakses pada tanggal 29  November 2011.

Anonim.  2011. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2010/12/pengambilan-dan-preparasi-sampel.html. diakses pada tanggal 30 November 2011

Anonim. 2011. http://eprints.undip.ac.id/13402/1/Laporan_penelian.pdf. Diakses pada tanggal 1 Desember 2011.

Barrow, G. I and Feltham, R.K.A.1993. Cowan and Steel’s Manual for The Identification of Medical Bacteria Third Education. Cambridge: University    Press, Australia.

Dwipayana., Herto. D. 2010. Identification of Bacterial Diversity in Waste Recycling Paint Sludge by Conventuonal Microbiological Technique. Environmental Engineering Study Program. Bandung.

James. J., Colin. B. 2008. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Penerbit Erlangga.

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia            coli dalam             Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif Detergen.Jurnal Biologi Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37.

Sudjadi. B., S. Laila. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan. Penerbit Yudhistira.

Priyani. N., Liliyanto., dan Kiki. N. 2006. Uji Potensi Bacillus sp. dan Escherichia coli dalam             Mendegradasi Alkil Berzen Sebagai Bahan Aktif                     Detergen.Jurnal       Biologi Sumatra. Vol. 1 (2). ISSN 1907-5537. Hal 35-37.

Sudjadi. B., S. Laila. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan. Penerbit Yudhistira.